Sephadex LH-20使用說明

Sephadex LH-20使用說明
1 Sephadex G型葡聚糖凝膠只適合在水中使用，SephadexG-25羥丙化后就是SephadexLH-20。其既有分子篩作用，在由極性與非極性溶劑組成的溶劑中還有反相層析效果。雖然價位很高，但由于性能頗佳，可再生利用，所以倍受親睞。此外上柱樣品損失很少，對處理小樣品較好，這也是實(shí)驗(yàn)室常用的原因之一。

2Sephadex LH20 的原理。

SephadexLH20的分離原理主要有兩方面：以凝膠過濾作用為主，兼具反相分配的作用（在反相溶劑中）。因?yàn)槟z過濾作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脫下來，小分子的化合物保留強(qiáng)，*后出柱。如果使用反相溶劑洗脫，SephadexLH20對化合物還起反相分配的作用，所以極性大的化合物保留弱，先被洗脫下來，極性小的化合物保留強(qiáng)，后出柱。如果使用正相溶劑洗脫，這主要靠凝膠過濾作用來分離。

3Sephadex LH20 洗脫溶劑。

SephadexLH20 洗脫溶劑因分為兩類：反相和正相兩種。用得*多的是反相溶劑洗脫，以甲醇－－水系統(tǒng)*為常見，先用水，逐漸增加甲醇比例，*后用100％甲醇沖柱。正相系統(tǒng)以氯仿－－甲醇*為常見，先用50％氯仿－－甲醇，逐漸增加甲醇比例，*后用100％甲醇沖柱。

4Sephadex LH20 樣品的處理和洗脫溶劑的選擇。

如果樣品極性大，這選用反相溶劑洗脫（甲醇－水），樣品用*少體積的甲醇－水（盡可能甲醇少一些）溶解，過濾后，濕法上樣（一定要濾！要是把Sephadex LH20 堵啦，就得將SephadexLH20 的柱頭部分棄去）。如果樣品極性小，這選用正相溶劑洗脫（氯仿－甲醇），樣品用*少體積的氯仿－甲醇溶解，過濾后，濕法上樣。

5Sephadex LH-20的步驟。

(1)選擇條件：

梯度洗脫在Sephadex使用中并不象在正相柱層析中那么重要。首先你的樣品須要能溶解在盡量少量的洗脫劑中。極性在的用甲醇水系統(tǒng);極性小者一般用不含水的系統(tǒng)。我們實(shí)驗(yàn)室常用正己烷二氯甲烷甲醇系統(tǒng)，用了很多年，效果較好。

(2)飽和層析柱：

用洗脫劑將凝膠搖勻，直立柱身，讓其自然沉降，此時要防止氣泡留在其中。至少半小時打開開關(guān)，流出幾個柱體種的洗脫劑，目的是使其膨脹在正確比例的洗脫劑中。

(3)樣品處理：用盡量少的洗脫劑溶解樣品，常壓過濾。

(4)濕法上柱。這也是要有技巧的步驟。

(5)洗脫：控制流速，一般1drop/s以下，可參見廠家的一些參數(shù);必要時更改極性（很多時一個極性就可以將樣品洗脫完畢）。再生以備下次使用。

6分離的技巧

（1） 流速不可太快，切切不可新急，所謂欲速則不達(dá)。

（2）柱子盡可能長， SephadexLH20 柱長的增加將極大地改善分離，所不要吝惜填料，寧可將填料全裝在一根大柱子中，不要將填料裝成幾根小柱。

（3） 餾分一定要接的細(xì)，可1／10，或1／20個保留體積接成一餾分。

（4） 洗脫體積一般為2-3個保留體積，對特殊保留強(qiáng)的化合物，可洗脫5個保留體積。

（5）鞣質(zhì)成分死吸附嚴(yán)重，不建議用LH20分鞣質(zhì)。

（6）SephadexLH20 對黃酮類成分的分離效果**，方法很成型，有大量文獻(xiàn)參考。

（7）填料反復(fù)使用，每次用完，一般可用甲醇將柱子洗干凈，然后用下一次分離的起步溶劑將甲醇替換出來，待用。

Sephadex  LH-20是由葡聚糖G-25羥丙基化加工而成，屬于分子篩凝膠，尤其適用于天然產(chǎn)物在有機(jī)溶劑中的純化。例如：類固醇、萜類、脂類以及小分子多肽等，Pharmadex  LH-20同時適用于分子類別非常相似的物質(zhì)的分離和工業(yè)規(guī)模的制備，既可用于初步純化步驟，也可用于*終精制步驟，如非對映同分異構(gòu)體的分離。
制備凝膠懸浮液
裝填的重要原則之一就是需要形成一個穩(wěn)定均一的柱床。膠顆粒越均一（粒徑分布越窄），越容易獲得穩(wěn)定均一的柱床。但是對于Sephadex LH-20而言，25～100μm的粒徑范圍相對于許多用于制備色譜的填料而言，不能說分布均一，也就是說其粒徑分布較寬。然而當(dāng)膠溶脹后就相對容易得到均一的柱床。這對于長柱（*高至250cm）而言也是同樣的。在裝柱前，層析柱和儲槽都必須進(jìn)行徹底的清洗。

Sephadex  LH-20在使用之前必須進(jìn)行溶脹。在溶脹的過程中，要盡量避免過分?jǐn)嚢?，否則會破壞球形膠粒，且要避免使用磁力攪拌器。
1．  在室溫下，將凝膠溶脹于層析溶劑中至少三小時，溶脹后膠體積的大小決定于所使用的溶劑系統(tǒng)，請參考后頁之干膠溶脹表計(jì)算特定柱體積所需要干膠的量。
2．  使溶脹膠體積沉淀之后占總體積的75%，上層溶劑占25%，這時，懸浮液從一個容器倒入另一容器時膠粒可移動。
3．  將溶脹后的凝膠根據(jù)裝柱要求均勻倒入柱內(nèi)，在保證膠粒不變形的前提下，應(yīng)在盡可能高的壓力下裝柱，反壓不要超過1.5ba。
平衡
上樣前，用洗脫液平衡層析柱至少兩個柱體積直到基線變得平穩(wěn)為止，如改變?nèi)軇?yīng)該注意凝膠在新溶劑中的溶脹性質(zhì)，并根據(jù)性質(zhì)確定柱高調(diào)節(jié)器的位置，如使用相同的溶劑，在以后的層析中柱平衡可以省略。
洗脫液
為確保延長層析柱的使用壽命，所有的緩沖液都應(yīng)該離心或經(jīng)過0.45um的膜過濾以除去雜質(zhì)。

樣品
樣品體積應(yīng)該占柱總體積的1-2%，同樣在使用之前樣品應(yīng)該離心或經(jīng)過0.45um的膜過濾。

洗脫
洗脫流速應(yīng)根據(jù)情況而定，*大張性流速約12cm/min（反壓1.5ba），建議流速為1-10cm/h?？傮w來說，較低的流速，具有較高的分辯率。
再生
凝膠再生通常是先用2-3個柱體積的洗脫液進(jìn)行清洗，如更換洗脫液，則需要重新平衡。
體積流速與線性流速的關(guān)系
線性流速=體積流速/橫截面積

溶脹體積
由于Pharmadex  LH-20的溶脹體積依賴于溶劑，所以對于不同直徑的柱可根據(jù)比例增加或減少舊柱體積以便計(jì)算出新體積。
新體積=舊體積×（新柱體積/舊柱體積）
膠的性質(zhì)
Sephadex  LH-20同時具備親水和親脂雙重性質(zhì)，且被分離物質(zhì)的極性在分離過程中起著重要作用。
排阻極限  4-5KD（與所用溶劑有關(guān)）
上樣量
吸附模式  取決于所需分辯率
分子量大小  小于總體積的20%
正相分配  小于總體積的1%
其他

膠粒形狀  球形，多孔
顆粒大?。ǜ桑?/span>  18-111um（直徑）
顆粒大小中間值（干）  70um（直徑）
顆粒大?。状迹?/span>  27-163  um（直徑）
顆粒大小中間值（甲醇）  103  um（直徑）
*大線性流速  720cm/min
參考線性流速  60  cm/min
pH的穩(wěn)定性
操作中  2-11
清洗中  2-13
化學(xué)穩(wěn)定性  在許多水溶液及有機(jī)溶劑系統(tǒng)中都穩(wěn)定。在pH2以下或強(qiáng)氧化劑中不穩(wěn)定
高壓**  121℃可忍受20分種
操作溫度  4℃到40℃
保存條件
新填料  4-25℃（干燥）
使用后填料  4-8℃，pH6-8切勿冷凍，加入抑菌劑（如20%乙醇0.04%疊氮鈉）

干膠溶脹表

*包含1%的乙醇

**包含1%的苯

***溶脹膠體積小于2.5ml/g的溶劑沒有使用價值

如果Sephadex LH20柱子被弄臟了，大多數(shù)情況下是由于樣品沒濾，將柱頭堵住，或由于樣品的死吸附（一般很少發(fā)生），使柱子的柱頭部分污染，一般的處理是將被污染的柱頭部分的填料棄去，具體做法很簡單，只將被污染的柱頭部分的填料用玻棒輕輕攪起，倒掉即可。如果柱子整個被污染，如果是將Sephadex LH20用反相被污染，辦法如下：依次用水，NaOH-NaCl水溶液，水，甲醇洗滌被污染的柱子。因?yàn)槭钦麄€柱子被污染，所以污染物一定不會完全死吸附在柱上（如果完全死吸附在柱上，污染物一定會只在柱頭部分），所以用合適的溶劑一定可以將之洗下來。

在更換洗脫溶劑或進(jìn)行調(diào)料再生時，需要特別注意溶劑更換的梯度不可以太大，以避免柱層中出現(xiàn)氣泡或鏤空。如果發(fā)現(xiàn)柱層時樣品色帶的走行出現(xiàn)明顯的速度不一致，建議重裝柱子。

NaOH-NaCl水溶液配法：8g NaOH 、30g NaCl、1000ml 水