對(duì)于所有形式的色譜法，都存在與樣品負(fù)載相關(guān)的限制——質(zhì)量和體積。這些是自變量，為了獲得zui佳結(jié)果，應(yīng)單獨(dú)調(diào)查。在這篇文章中，我將討論增加溶劑體積對(duì)快速色譜分離的影響。
確定zui大加載體積的一個(gè)相關(guān)且關(guān)鍵的變量是溶解溶劑（樣品溶劑）的選擇。如果溶劑強(qiáng)度太高，則會(huì)導(dǎo)致峰變寬，并zui終導(dǎo)致產(chǎn)品損失，因?yàn)槟承悠窌?huì)以 1 CV 與樣品溶劑一起洗脫。
正如之前的帖子中提到的，在可能的情況下，zui大限度地提高樣品濃度溶解溶劑中 ，以zui大限度地提高分離性能。
為了幫助說(shuō)明溶解溶劑和進(jìn)樣體積的作用，我將展示溶解在兩種不同溶劑，甲醇 (MeOH) 和二甲亞砜 (DMSO) 中的反應(yīng)混合物的純化數(shù)據(jù)。
馬尿酸 (~0.5 g) 和 α-甲基芐胺 (~0.4 g) 在乙酸乙酯 (EtOAc) 中在 200 °C 下反應(yīng) 10 分鐘，使用 Biotage Initiator+ 微波合成儀進(jìn)行兩次。合成后，我將每個(gè)反應(yīng)轉(zhuǎn)移到自己的 20 mL 閃爍瓶中，并使用 Biotage V-10 Touch 蒸發(fā)掉 EtOAc。
反應(yīng)1產(chǎn)生932.5毫克，而反應(yīng)2產(chǎn)生的總質(zhì)量為 942.5 毫克。將反應(yīng)1溶解在 MeOH 中至體積為5mL，而將反應(yīng)2溶解在相同總體積的 DMSO 中。選擇這些溶劑是因?yàn)樗鼈兲峁┝送耆姆磻?yīng)混合物溶解度。
在本研究中，我在Biotage Isolera Dalton 2000 上使用了 12 克 Biotage Sfar C18 色譜柱。12 克C18 色譜柱的柱體積 (CV) 為 17 mL。注射量需要根據(jù)CV的百分比來(lái)考慮，并應(yīng)保持盡可能小。我選擇道爾頓2000系統(tǒng)是因?yàn)樗軌虼_定是否有任何反應(yīng)混合物組分與溶解溶劑一起洗脫，這是體積過(guò)載的明顯跡象。
第1個(gè)測(cè)試使用了一個(gè)小的0.1mL上樣量 (~18.75 mg)，相當(dāng)于色譜柱體積的0.6%。使用這個(gè)小體積，兩個(gè)樣品提供了相同的色譜，圖 1。 
圖 1. 上樣量為 0.1 mL (0.6% CV) 的反應(yīng)混合物純化溶解溶劑的色譜比較。頂部 - MeOH 溶解的反應(yīng)混合物。底部 - DMSO 溶解的反應(yīng)混合物。
測(cè)試二將進(jìn)樣體積增加到0.5mL (~93.75 mg)，等于色譜柱體積的 2.9%。在這里，我們可以看到甲醇樣品的峰開(kāi)始變寬，但仍能提供出色的分離效果，圖 2。 
圖 2. 上樣量為0.5mL (2.9%) 的反應(yīng)混合物純化的比較。頂部 - MeOH 溶劑化反應(yīng)混合物。底部 - DMSO 溶劑化反應(yīng)混合物。
在zui后一次測(cè)試中，進(jìn)樣量加倍至1mL (~187.5 mg)。在此體積下，即色譜柱體積的 5.9%，甲醇樣品顯示出較大的分離度損失，這是由于較寬的峰以及在溶劑前沿洗脫的產(chǎn)物。然而，DMSO 樣品仍然產(chǎn)生了出色的分離效果，沒(méi)有產(chǎn)物與 DMSO 峰一起洗脫，并且有進(jìn)一步增加負(fù)載的空間，圖 3。 
圖3. 1mL上樣體積（CV 的 5.9%）的色譜比較。頂部 - MeOH 溶劑化反應(yīng)混合物，其中可以看到樣品穿透以及峰變寬和分辨率損失。底部 - DMSO 溶劑化反應(yīng)混合物顯示沒(méi)有突破和完全分辨率。
如您所見(jiàn)，樣品溶劑的選擇對(duì)純化質(zhì)量有重大影響。雖然甲醇的極性相當(dāng)大 ( log P -0.77 )，但它是梯度中的強(qiáng)溶劑，限制了其加載體積范圍。另一方面，DMSO 極性很強(qiáng)（ log P -2.03 )并且是一種非常好的溶劑，DMF 也是一種極好的溶解溶劑選擇。 DMSO 廣泛的溶劑化特性和非常高的極性使其成為我想要zui大限度地提高負(fù)載和純化通量時(shí)的反相溶解溶劑的選擇。
如果您使用甲醇，甚至乙腈作為樣品溶劑，請(qǐng)將體積保持在色譜柱體積的 3% 以下。如果您將樣品溶解在 DMSO 中，您可以合理地期望在保持分離的同時(shí)至少將進(jìn)樣體積和質(zhì)量負(fù)載增加一倍。
