色譜既是一門科學(xué)，也是一門藝術(shù)。在合成反應(yīng)產(chǎn)物和天然產(chǎn)物之間，需要分離、純化和分離的化合物范圍廣泛且多樣，不時(shí)帶來挑戰(zhàn)。由于這種多樣性，并不是所有的色譜分離都可以用“中性”溶劑系統(tǒng)進(jìn)行——一個(gè)不添加pH調(diào)節(jié)劑或緩沖液的系統(tǒng)。
您可能不知道反應(yīng)產(chǎn)物或副產(chǎn)物的pKa，那么您如何知道何時(shí)在流動(dòng)相中加入酸？根據(jù)您的反應(yīng)，如果需要分離可電離/離子化合物或固有酸性/堿性化合物，則流動(dòng)相改進(jìn)劑可能非常有用。在這篇文章中，我展示了一些降低流動(dòng)相pH值可以改善峰形狀或提高分離選擇性的例子。
低pKa化合物
純化低pKa的化合物時(shí)，zui好酸化流動(dòng)相，以盡量減少或消除化合物電離。一個(gè)很好的經(jīng)驗(yàn)法則是將流動(dòng)相的 pH 值降低 2 個(gè)單位，低于目標(biāo)化合物的 pKa。對于反相，這可以通過向每種溶劑中添加甲酸、乙酸或三氟乙酸來實(shí)現(xiàn)，或者創(chuàng)建第三種酸化溶劑，如果您的閃蒸系統(tǒng)具有該能力，則可以等比例混合。等度法是我在以下示例中使用的方法，1）使用Biotage®Selekt系統(tǒng)分離馬尿酸（pKa 3.6）和靛酸酐，2）使用Biotage®Isola Dalton 2000純化酰胺反應(yīng)產(chǎn)物。
對于實(shí)施例1，在中性條件下，我們看到馬尿酸峰的主要前沿和扭曲的靛酸酐峰，圖1。發(fā)生這些現(xiàn)象的原因是化合物，尤其是馬尿酸，在溶液中部分解離，既作為完整化合物存在，也作為電離化合物存在。與母體化合物相比，電離形式更具極性，保留更少，因此想要更早地洗脫，從而產(chǎn)生馬尿酸和不對稱形狀的馬尿酸。
圖1.馬尿酸和靛酸酐的中性pH溶劑分離。
為了消除這些問題，我在梯度中添加了酸性改性劑溶劑（1% TFA 水溶液），濃度為總?cè)軇┙M成的10%，形成了0.1%的TFA改性流動(dòng)相。添加的酸將兩種化合物質(zhì)子化為其天然形式，使洗脫帶銳化，并略微增加保留（由于疏水性增加），圖2。
圖2.流動(dòng)相酸化的結(jié)果是兩個(gè)峰的銳化。
選擇性改進(jìn)
反相方法開發(fā)的一個(gè)關(guān)鍵方面是zui大化選擇性，即相鄰洗脫化合物之間的分離程度。有時(shí)，只需將有機(jī)溶劑從乙腈改為甲醇或?qū)⒓状几臑橐译?，即可改變選擇性。然而，在其他情況下，向流動(dòng)相中添加酸會(huì)改變產(chǎn)物、副產(chǎn)物或可能所有化合物的電離，從而影響色譜選擇性。
我們可以通過實(shí)例2看到這一點(diǎn)，即琥珀酸與α-甲基芐胺的反應(yīng)產(chǎn)物。使用中性pH值，產(chǎn)物（+m/z 221.8）和副產(chǎn)物（+m/z 342.8）共洗脫，圖3。
圖3.用pH中性流動(dòng)相純化酰胺反應(yīng)混合物。產(chǎn)物+m/z 221.8具有表明類似疏水性的共洗脫副產(chǎn)物（+m/z 342.8）。
然而，通過以等比例引入0.1%乙酸作為第三種溶劑，較高分子量的副產(chǎn)物被電離，迫使其比合成產(chǎn)物更早洗脫，同時(shí)產(chǎn)物保留也增加，進(jìn)一步提高了純化效率，見圖4。
圖4.酸化流動(dòng)相質(zhì)子化產(chǎn)物及其共洗脫副產(chǎn)物，提高純化效率。
那么，是什么原因?qū)е逻@兩種化合物相對彼此轉(zhuǎn)移了保留率呢？通過降低流動(dòng)相的pH值，一個(gè)質(zhì)子被加入到流動(dòng)相中，這將導(dǎo)致任何pKa高于流動(dòng)相pH值的化合物電離。電離化合物比中性化合物更具極性，對疏水固定相的親和力更小，在極性流動(dòng)相中的溶解度更大。同樣，pKa等于或低于流動(dòng)相的化合物將質(zhì)子化，從而增加其疏水性和在反相柱上的保留。
